原位生態修復技術是利用沉水植物在養殖塘中的控藻增氧效應，對養殖塘中氮、磷等營養物質的吸收同化作用，并應用魚、草、蟹、蝦、貝等構建水域生態系統，完善食物鏈網，同時提供天然飼料和水生動物棲息地，改善養殖塘環境；結合異位生態處理塘、養殖工藝特點進一步削減養殖污水排放，同時從水產養殖健康生態系統角度分析，發揮水域生態系統功能，形成生態化健康養殖模式［１－２］。而浮游細菌是水生態系統的分解者和小型濾食性動物的餌料，在湖泊生態系統的物質循環和能量流動中具有重要的作用，水質的優劣、水體生態狀況的改變都會對細菌群落的組成產生影響［３］。此外，水產養殖系統內細菌在物質循環、病害發生與否及水產養殖對象的生長、營養和免疫方面都產生重要作用，與水產養殖系統有關的微生物群落結構研究也有報道，但對于系統微生物狀況的持續變化以及養殖菌劑對微生物系統影響的報道不多［４－７］。隨著分子生物學方法的發展，以基因檢測為基礎的微生物檢測方法在群落結構的動態監測中具有快速、便捷的優點，變性梯度凝膠電泳（ＤＧＧＥ）是目前應用較為廣泛的微生物群落結構分子生物學檢驗方法之一。筆者除了采用傳統法研究微生物數量變化之外，還采用ＤＧＧＥ技術對在養殖區內微生物群落結構的變化開展了較深入的研究，旨在為陸域養殖系統的生物修復提供理論基礎。

１材料與方法

１．１材料

實驗基地位于江蘇無錫市郊胡埭鎮龍延村直湖港岸邊。由于水產養殖主要收獲季節在６—１０月，于２００９年和２０１０年的６月、８月、１０月３個月在無錫直湖港陸域水產養殖區內采集水樣，養殖區包括進水口、蟹塘１號、蟹塘２號、蟹苗塘、魚塘１號、魚塘２號、魚苗塘及甲魚塘８個點（圖１）。

１．２方法

１．２．１環境細菌的檢測和樣品總ＤＮＡ的提取

采用平板培養法測定異養細菌數量，用０．２ｍ的聚碳酸酯膜過濾２００ｍＬ水樣富集水中的細菌，采用申能博采的“環境樣品ＤＮＡ提取試劑盒”進行水樣細菌總ＤＮＡ的提取，具體操作方法參見說明書。

１．２．２ＰＣＲ－ＤＧＧＥ擴增

根據參考文獻［１０］，采用上海英駿公司合成的引物序列Ｐ３３８ｆＧＣ：５’－ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３’和５１８ｒ：５’－ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ－３’，用于擴增細菌１６ＳｒＤＮＡ的Ｖ３區段，片段長度為２３６ｂｐ。擴增總體系為５０μＬ：模板ＤＮＡ４０～８０ｎｇ；１０ｍｍｏｌ／Ｌ４×ｄＮＴＰｓ１．５μＬ，５Ｕ／μＬＴａｑ酶１μＬ，２０ｐｍｏｌ／μＬ引物各１．５μＬ，１０×擴增緩沖液（含Ｍｇ２＋）５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ補足至５０μＬ。ＰＣＲ擴增條件：９４℃預變性５ｍｉｎ；９４℃１ｍｉｎ，５５℃退火３０ｓ，７２℃３ｍｉｎ，３５個循環；７２℃延伸１０ｍｉｎ。反應產物直接用于變性梯度凝膠電泳（ＤＧＧＥ）分析。

１．２．３ＰＣＲ－ＤＧＧＥ凝膠電泳及結果處理

ＤＧＧＥ凝膠電泳∶所用膠濃度為８％（丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺＝３７．５∶１，體積比），細菌ｐａｇｅ膠變性梯度５５％～７０％，真核生物變性梯度３０％～５０％，用１×ＴＡＥ作為電泳緩沖液。每孔上樣量５０μＬ。在６０℃，１５０Ｖ電泳３００ｍｉｎ后溴化乙錠染色，紫外凝膠成像觀察。通過ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ軟件將ＤＧＧＥ圖譜照片轉化成數字信號，運用ＭＳＶＰ軟件對ＤＧＧＥ指紋圖譜的多樣性和相似性數據進行計算，用ＳＰＳＳ軟件進行主成份分析（ＰＣＡ分析）。多樣性和相似性的計算方法分別采用香儂威納（Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅ－ｎｅｒ）多樣性指數和索倫森相似性系數（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ’ｓＣｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）表示。

２結果與分析

２．１細菌數量變化

從異樣細菌變化情況（圖２）可知，養殖區內的異樣細菌數量變化波動較大，特別是２個魚塘的細菌數量波動可達１０倍以上。從圖３也可看出，采用綜合治理技術的蟹塘１號及蟹塘２號的微生物數量明顯下降，分別從２００９年的６５００個／ｍＬ及１１０００個／ｍＬ下降到２０１０年的１５００個／ｍＬ和２０００個／ｍＬ，水質凈化效果明顯，證明綜合治理技術確有效果。在其他養殖塘內，魚塘的細菌數量一直較高，最高１７０００個／ｍＬ，兩年的平均值也都在１００００個／ｍＬ上下波動，這可能與養殖密度較高有關，相對魚苗塘和甲魚塘細菌數量變化較小，平均值都在５０００個／ｍＬ左右。統計數據亦表明，２０１０年的微生物數量總體低于２００９年同期，這可能與養殖方式的改進以及太湖整體水質變好有關。

２．２水樣細菌的１６ＳｒＤＮＡ多態性

采用ＤＧＧＥ分析ＰＣＲ產物，均得到若干分離的條帶（圖４）。每個月的電泳圖譜條帶一直在變化，而且每個圖譜中共有條帶并不多見，因此，在不同的養殖系統內，微生物的變化非常明顯，很難找到共有的微生物的存在。盡管８個養殖池水是相通的，但每個池內的小生態系統對微生物的影響較大，導致這一變化的出現。

２．３細菌的Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅｎｅｒ多樣性指數

由圖５可見，８個樣點的香農威納指數都在２．０以上，多樣性較好，進水、蟹塘以及魚塘２號的多樣性指數變化稍大，可能與生態系統不太穩定有關，而魚苗塘、甲魚塘的多樣性指數較為穩定，聯系微生物數量來看，這２個塘的生態系統較為穩定，可能與兩塘受到的外界干擾較少有關。從圖６可見，２０１０年的微生物多樣性普遍高于２００９年，這也表明，２０１０年微生態系統情況好于２００９年，也從另一個方面說明水質有變好的趨勢。